成功设计 IHC / ICC 实验方案 免疫组化 免疫细胞化学

免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)是用于定位抗原表达的技术,并且依赖于特定的表位-抗体相互作用。IHC指使用组织切片,而ICC指使用培养的细胞或细胞悬液。在这两种方法中,使用分子标记可以显示阳性染色,该分子标记可以是荧光的或发色的。简而言之,将样品固定以保持细胞完整性,然后将其与封闭剂一起孵育以防止抗体的非特异性结合。随后将样品与一抗和二抗孵育,并将信号可视化以进行显微镜分析。

从技术上讲,IHC / ICC是相对简单直接的实验方法。但是,对于每个单独的IHC / ICC研究,必须识别和优化许多变量。这些技术最具挑战性的方面是确定为每种目标抗原产生强而特异性的信号所必需的实验条件。例如,在培养的细胞中检测到丰富的蛋白质可能需要较短的固定时间,最小限度的阻断,并且可能与使用荧光染料偶联的一抗直接可视化兼容。相反,在冷冻组织的切片中检测磷酸化依赖性抗原决定簇可能需要抗原回收并且依赖于扩增的显色显像。

用于实验设计和优化的变量

变量因素
抗原种类,表达水平,样品类型和亚细胞位置
表位依赖于构象或翻译后修饰
样品类型组织或细胞
样品制备组织:嵌入式或冷冻
细胞:粘附的细胞培养物或细胞悬液
适当的控制无一抗,同种型控制,吸收控制,组织类型控制
固定方法灌注或浸泡(冷冻或不冷冻)
固定剂*甲醛,酒精或丙酮
封闭剂*正常血清,牛血清白蛋白(BSA)或脱脂牛奶
抗原提取*蛋白酶诱导的表位检索(PIER)或热诱导的表位检索(HIER)
检测方法直接或间接(有或没有放大)
一抗*单克隆或多克隆
二抗*种类和标签
贴标方法荧光或发色
标签荧光染料和光谱特性
色原体:3,3’二氨基联苯胺(DAB),3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)
复染色*荧光:4,6′-二mid基-2-苯基吲哚(DAPI)发
色:苏木精
安装试剂荧光:防褪色固定介质发
色:水性固定介质
可视化与分析荧光显微镜或标准光学显微镜
*这些变量需要优化其他因素,包括浓度,pH,温度,孵育时间和稀释剂。

该表并非旨在全面介绍,而是代表R&D Systems最常用的IHC / ICC方法。

来自:R&D Systems,参考英文原文:

https://www.rndsystems.com/cn/resources/technical/designing-successful-ihc-icc-experiment

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