PCR 优化的一般指导原则

概述
NEB 针对基于 PCR 的应用提供多种 DNA 聚合酶。在产品的说明书或产品的网页介绍上可以找到针对不同产
品的特定优化建议。下面的一般指导原则将帮助您的 PCR 实验顺利进行。 

反应建立指南

DNA 模板
• 尽可能使用高质量、经过纯化的 DNA 模板。PCR扩增未纯化的DNA 时(菌落 PCR 或直接 PCR),请参阅特定
  的产品信息
• 对于低复杂度的模板(如质粒、λ或BACDNA),每 50 μl 反应体系加入 1 pg-10 ng DNA
• 对于高复杂度的模板(如基因组DNA),每 50 μl 反应体系加入 1 ng-1 μg DNA
• DNA 浓度增高会降低扩增特异性,尤其是循环次数较多时

引物
• 一般长度为 20-40 个核苷酸
• 理想的 GC 含量为 40-60%
• 引物的 Tm 值可通过 NEB 的 Tm Calculator 计算 (www.neb.com/TmCalculator)
• 退火温度应根据特定酶的推荐温度设定。请注意 Q5® 和 Phusion®* 推荐的退火温度是特别的
• 两条引物间 Tm 差值应在 5℃ 以内
• 避免引物形成引物内二级结构(如发卡结构)以及引物二聚体
• 每条引物的终浓度应为 0.05-1 μM。请参阅特定酶的详细推荐信息
• 引物浓度过高可能导致非特异性引物结合,并产生非特异性扩增产物
• 当扩增产物的大小超过 20 kb 时,引物长度应≥ 24 个核苷酸,GC 含量应在 50% 以上,Tm 值应在 60℃ 以上
• 当引入限制性位点时,需要在识别位点 5´ 端额外添加 6 个碱基
• 为了消除引物降解以及后续的非特异扩增,可使用热启动聚合酶(如 One Taq® 热启动 DNA聚合酶或 Q5 热
  启动超保真 DNA 聚合酶) 

镁离子浓度
• 对于大多数 PCR 聚合酶,Mg2+ 最佳浓度通常为 1.5-2.0 mM
• NEB 提供的大多数 PCR 缓冲液在 1 倍浓度下已含有足够浓度的 Mg2+关于 Mg2+ 请参阅特定酶的产品信息
• NEB 提供多种不含 Mg2+ 的缓冲液,在需要严格控制 Mg2+ 浓度的实验中,可向其中补加 Mg2+
• 如果需要,可通过将 Mg2+ 浓度增加 0.2–1 mM来进一步优化。在某些特定试验中,聚合酶可能需要高达
  6 mM 的镁离子
• Mg2+ 浓度过高可能导致出现非预期 PCR 产物
• Mg2+ 浓度过低可能导致反应失败

dNTPs
• 理想的 dNTP 浓度通常为每种 200 μM,但是某些聚合酶可能需要每种 dNTP 的浓度高达 400 μM。请参阅特
  定产品的说明书获取详细的推荐信息
• 过量的 dNTP 会螯合 Mg2+ 并抑制聚合酶的活性
• dNTP 浓度过低可增加保真性,但会减少产量
• 当使用古生菌 PCR 聚合酶时,引物、模板或dNTP 混合液中的尿嘧啶会导致反应失败。针对这类反应可使用
  OneTaq 或 Taq DNA 聚合酶聚合酶浓度
• 反应中的最佳聚合酶浓度因酶而异。请参阅特定产品的说明书获取详细的推荐信息
• 一般而言,过量的聚合酶会导致扩增失败,特别是扩增长片段时

建立反应
• 除非使用热启动聚合酶(如 OneTaq 热启动DNA 聚合酶或 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶)否则需在冰上混合
  各种反应组份
• 尽可能最后加入聚合酶
• 建立好反应体系后立即放入已经预热至变性温度的热循环仪中。请注意在使用热启动聚合酶(如 OneTaq 热启
  动 DNA 聚合酶或Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶)时无需预热热循环仪 

循环条件指南

变性
• 最佳的变性温度范围为 94℃-98℃,并因酶而异。请参阅特定产品的说明书获取详细的推荐信息
• 避免长时间或高温度温育(除非模板富含 GC)
• 通常,热循环过程中变性时间为 5-30 秒
• NEB 提供基于核酸适配子的热启动聚合酶,无需额外变性步骤以激活聚合酶

退火
• 引物的 Tm 值可通过 NEB 的 Tm Calculator 计算 (www.neb.com/TmCalculator)
• 除 Q5 超保真 DNA 聚合酶或 Phusion 超保真DNA 聚合酶*以外,退火温度一般设定为比引物对的最低 Tm 值
  低 2℃-5℃
• 使用 Q5 超保真 DNA 聚合酶或 Phusion 超保真 DNA 聚合酶*时,退火温度一般设定为比引物对的最低 Tm
  值高 0℃-3℃。请参阅特定产品的参考文献获取详细的推荐信息
• 通过优化退火温度或改用热启动 DNA 聚合酶(如 OneTaq 热启动 DNA 聚合酶或 Q5 热启动超保真 DNA 聚
   合酶)可避免形成非特异产物
• 通过温度梯度 PCR 可优化退火温度,将起始温度设定为比引物对的最低 Tm 值低 5℃
• 理想状态下,引物 Tm 值应比延伸温度低。但是,如果计算出的 Tm 值比延伸温度高,可采用两步法 PCR
 (将退火和延伸合并为一步) 

延伸
• 推荐的延伸反应温度范围为65℃-72℃,因酶而异。请参阅特定产品的说明书获取详细的推荐信息
• 延伸速率因酶而异。一般而言,延伸速率范围为15-60 s/kb。请参阅特定产品的说明书获取详细的推荐信息
• 过长的延伸时间会增加错配率,增加非特异扩增和/或减少扩增产量

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