免疫组化(IHC)实验手册

免疫组织化学技术(immunohistochemical),简称:免疫组化,是指利用抗原(antigen)与抗体(antibody)间特异性结合的原理,对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位的定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术,50年代以后逐渐发展建立起高度敏感,且更为实用的免疫酶技术。

免疫组织化学的全过程包括:抗原的提取与纯化;免疫动物或细胞融合,制备特异性抗体以及抗体的纯化;将显色剂与抗体结合形成标记抗体;标本的制备;免疫细胞化学反应以及呈色反应;观察结果。

免疫组化(IHC)实验类型:

一、免疫荧光细胞化学技术

免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针,检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体),形成的抗原抗体复合物带有荧光素,在荧光显微镜下,由于受高压汞灯光源的紫外光照射,荧光素发出明亮的荧光,这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质,并可利用荧光定量技术计算抗原的含量,以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。

二、免疫酶细胞化学技术

抗体与靶抗原结合之后,形成的抗原抗体复合物在显微镜下是不可见的,如将抗体(或抗原)与某种显色剂偶联,抗原与抗体结合形成的复合物就由不可见而成为可见,从而可以确定组织中是否存在某种抗原(或抗体)。

免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原),然后与组织标本在一定条件下反应,如果组织中含有相应抗原(或抗体),抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时,能催化底物水解、氧化或还原,产生显色反应,这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质,通过图像分析并可达到定量的目的。

免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断,但是荧光抗体染色标本不能长期保存,对组织细胞的细微结构分辨不清,免疫酶技术则能克服上述不足,标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法,对石蜡切片标本尤为适用,为免疫病理研究开辟了一条新途径。另外,酶显色产物具有较高的电子密度,经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。

免疫组化(IHC)实验步骤:

  1. 免疫组化(IHC)样品制备

    组织样品的制备方法决定了如何用抗体检测抗原。选择满足预期实验结果需要的组织类型相兼容的固定方法是很重要的。如果您需要好的抗原修复结果并且不必保持细胞形态,则使用冰冻组织或丙酮固定。当需要保持细胞形态时,福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品是一个好的选择。

  2. 免疫组化(IHC)抗原修复

    抗原修复是免疫组化(IHC)在进行抗体标记前的必要步骤,因为组织的固定过程通常会引起蛋白交联。这在使用福尔马林固定时因其化学属性而经常发生,但可以通过加热(最常用的方法)、简易缓冲液处理或蛋白酶消化而轻松实现逆转。处理的方式可根据抗体检测所需的表位构型而进行选择。该步骤可使得抗原表位被重新暴露以便于抗体的结合。

  3. 免疫组化(IHC)背景封闭

    组织中内源性酶和抗体的封闭对于背景染色的最小化以及降低假阳性染色十分重要。这通常是通过用可封闭一抗或二抗也可能结合的非特异性位点的特定缓冲液对样品进行孵育而实现的。

  4.  免疫组化(IHC)检测目标

    在选择一抗时,确保其已通过验证可用于免疫组化(IHC)应用。

  5. 免疫组化(IHC)样本观察

    可采用数码显微镜或电子显微镜观察。

免疫组化(IHC)实验操作:

Immunohistochemistry Protocols(来自ThermoFisher)

Our staining kits are provided with complete protocols for use. This page lists the steps involved in using selected Histostain(TM) kits and the time required for each step. It also contains protocols for removing endogenous peroxidast, digesting tissue and antigen recovery.

1. Removal of Endogenous Peroxidase Activity

Procedure 1: (Use for paraffin-embedded sections. Not for frozen sections.) Prepare peroxidase blocking solution by adding one part 30% hydrogen peroxide to nine parts methanol. Submerge slides in this solution for 10 minutes. Wash three times with PBS.

Procedure 2: (May be used with frozen or paraffin-embedded sections.)

Treat slides with Peroxo-block(TM) for 45 seconds. Wash immediately.

2. Removal of residual biotin, avidin or streptavidin activity

Residual Biotin: Incubate section with the avidin solution from our Avidin/Biotin Blocking Kit. Wash. Incubate with the d-biotin solution from the kit. Wash thoroughly.

Residual Avidin or Streptavidin: Incubate section with the d-Biotin solution from our Avidin/Biotin Blocking Kit. Wash thoroughly.

3. Heat Induced Epitope Retreival

The epitope retrieval procedure is used to reverse the loss of antigenicity that occurs with some epitopes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. We have found that some antibodies require Antigen Recovery (e.g., estrogen receptor, and Ki-67 antibodies), while the staining of many other antibodies will be enhanced by Antigen Recovery (e.g., S-100, cytokeratin, and synaptophysin antibodies). No licensing fee is required for using Antigen Recovery.

A. Materials

  • Hot plate

  • 1 liter glass beaker

  • 0.01 M citrate buffer, pH 6.0 (No. 00-5000)

  • EDTA Solution (Cat. No. 00-5500 for antibodies that require EDTA instead of citrate buffer)

  • PBS

B. Protocol

  1. Mount tissues should on silane or poly-L-Lysine coated slides, or slides coated with HistoGrip(TM). 

  2. Deparaffize slides and, if desired, perform avidin/biotin blocking and endogenous enzyme quenching (see above). 

  3. Wash slides with distilled water 3 times for 2 minutes each. 

  4. Put the slides in a slide rack and place it in a 1 liter glass beaker (Pyrex) containing 500 ml of 0.01 M citrate buffer. 

  5. Place beaker on hot plate. Heat the solution until it boils and keep it boiling for 10 minutes. 

  6. After heating, remove beaker from the hot plate and allow it to cool down for at least 10-20 minutes at room temperature. 

  7. Rinse slides with PBS and start the immunostaining protocol.

4. Tissue Pre-digestion

Tissue digestion recommendations for all predilute and 50x concentrated IHC antibodies are given in our Anatomical Pathology Catalog. Tissues should be mounted on slides using HistoGrip(TM), Para-Pen , Fro-Pen, silane, or poly-l-lysine.

  1. Deparaffinize, rehydrate, and quench endogenous enzyme activity (if necessary).

  2. Wash slides with distilled water 3 times for 2 minutes each.

  3. Incubate sections with proteolytic enzyme at 37oC. Incubation time should be determined for each application (for digestion reagents standardized for 10 min incubations, inquire about Digest-All(TM)

  4. Rinse slides with PBS 3 times for 2 minutes each and continue the immunostaining procedure.

5. Procedure for Histostain-SP and Histostain-SAP Kits

  1. Prepare slides and controls, and perform peroxidase blocking step if necessary. 

  2. Incubate section for 10 min. with Serum Blocking Solution. Drain and blot away excess. 

  3. Incubate with user-supplied Primary Antibody (30-60 min. at room temperature is usually sufficient). Wash. 

  4. Incubate for 10 min. with Biotinylated Second Antibody. Wash. 

  5. Incubate for 10 min. with Streptavidin-Enzyme Conjugate. Wash. 

  6. Incubate for 5-10 min. with Substrate-Chromogen mixture. Wash. 

  7. Counterstain with Hematoxylin and mount with Aqueous Mounting Solution.

免疫组化(IHC)样品处理步骤常见问题及建议:

问题:无染色或染色弱

                    可能原因                   建议
切片过于陈旧 使用新鲜的切片;如果需要进行保存,保存在4°C
玻片上的组织已干化 重新补充水分并在染色过程中保持组织被覆盖在缓冲液中
不均衡的背景染色可能意味着脱蜡不正常 使用新鲜的二甲苯并延长脱蜡时间

问题:高背景值

可能原因 建议
洗涤不充分;由于固定剂的残留而导致高的背景值 确保在步骤之间用PBS至少洗3次
固定不充分;可能会导致抗原在组织中的扩散 降低固定后时间  
弥散染色;由组织损伤导致 小心制备组织样品以避免组织损伤
检测试剂的渗透不充分 制备更薄的切片
不同固定剂对于组织抗原影响各异 优化pH,孵育时间和温度

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